mtDNA异质性及其法医学应用

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【关键词】mtdna；异质性
【中图分类号】d919．2
【文献标识码】b
【文章编号】1007—9297(20xx)02—0140—04
线粒体dna(mitochondrial dna，mtdna)是惟一
的细胞核外dna。人类mtdna为一luo露的环状双链
结构，长16569 bp，由富含嘌

呤的重链(h链)和富含
嘧啶的轻链(l链)组成。mtdna编码区的序列相对保
守，其非编码区长1 122 bp，又称为控制区。控制区的
碱基变异相对集中分布在15996～16401nt和29～408
nt两个区段，分别称为hv i和hvli。后来，lutz等【l】
发现在438～574nt间也存在较多的碱基变异，称为
hvⅲ。mtdna呈母系遗传特征，加之其拷贝数多、突
变率高、抗腐败能力强，具有极高的法医学应用价值。
个体发育源于一个受精卵，理论上同一个体所有
的mtdna序列应是一致的。但实际却发现有少数同
一个体的mtdna碱基序列并不完全相同。这种同一
个体mtdna出现两种或两种以上的碱基序列的现象
称为异质性(heteroplasmy)。121其在人体的存在表现为
同一个体不同组织、同一组织不同细胞或同一细胞不
同线粒体之间存在不同的mtdna序列。
一
、mtdna异质性形成的可能机理
mtdna异质性发生机制至今还不是很清楚
hauswi~h和laipis(1982)在研究牛线粒体dna多态
性时发现异质性线粒体dna在卵母细胞和胚胎早期
发育阶段发生快速分离的现象，从而提出线粒体dna
遗传的瓶颈理论。[31后来人们多用该理论来解释
mtdna异质性的形成原理。
mtdna异质性的本质是突变．即突变型和野生型
mtdna以不同比例共存，其发生与mtdna拷贝数多、
不对称复制及缺乏校正修复机制等密切相关。瓶颈理
论认为：卵母细胞在分化成卵细胞及形成受精卵的过
程中，卵母细胞和受精卵中数千个mtdna子集合群
体(不同序列mtdna混合)，似通过瓶颈一样的阻塞
作用而使各个mtdna子集合群体数量明显减少，只
有少数mtdna进行选择性复制，故一种突变基因型
可以占优势并固定出现在下一代中。ashley等[41发现
该“瓶颈理论”结果与人类mtdna相似，即在单个个
体中异质性的大小可以改变，子代可以有不同的基因
型，仅仅两三代异质性就可以转为同质性。
共存的突变型和野生型mtdna通过减数分裂或
有丝分裂随机分布到子代细胞中，由此细胞中突变型
和野生型mtdna比例随之发生随机增减，也称遗传
渐变，最终，再分裂的子代细胞有向全部为突变型或
野生型mtdna。即同质体的方向发展的趋势，该过程
称为“复制分离”。随着复制分离和遗传渐变的发生，
一些mtdna中选择作用不明显的突变建立起同质
体．并以一定的频率保留于人群中．形成mtdna某些
区段的多态性。然而，一些重度突变因复制分离造成
的同质体个体极易因自然选择而淘汰。因而，多数重
度突变无法建立起同质体，表现为异质体，异质体在
人群中往往只能建立较低频度的多态性。
遗传瓶颈出现在卵细胞形成过程中的推测后来
得到了证实。bendall等【5i研究了180对双胞胎，其中
发现4例有异质性。采用遗传渐变理论模式推算，估
计减数分裂的代间瓶颈大约有2至，100个分子．对于
特定的母子间传递的mtdna估计有3～2o个分子
作者计算人mtdna—hvi的突变和固定的率在1．2x
1o ～2．7×10-5／每代、每位点之间，相当于1个转位
突变／2500年至1转位突变／55000年的范围。调查结
果与其他文献报告基本相符，说明遗传瓶颈相对比较
狭窄，形成了一种制约因素。调查结果也证实，不同的
母系间的瓶颈大小确有差异。
一个成年人体内mtdna估计有一兆，mtdna复
制聚合酶缺乏忠实性，受精后的细胞发育过程中出现
变异，形成组织间mtdna型别差异的可能性的确存
在。有研究发现原胚层组织异质性是一致的，胎儿各
组织型别一致，但到了成人，不同组织的异质性分布
【作者简介】翟仙敦(1977一)，女，山西临汾人，硕士研究生，助教，主要从事法医遗传学研究。tel：+86—027—83692645；e—mail：san—
mao506@ 163．corn 。
法律与医学杂 www.duowen123.com (www.duowen123.com)志20xx年第l3卷(第2期)
出现差异。tully等(1998)用dgge方法检测21名成
年人不同组织如血、骨、毛发、肝、肌肉，发现异质性出
现的程度有差异，有的容易检出 有的不能检测。研究
资料显示，在细胞分化、发育过程中，也可有mtdna
控制区碱基变异。实验观察组织问异质性的发生存在
与

卵细胞形成过程中类似的瓶颈，ciafaloni等发现同
一个体不同组织变异型与野生型mtdna出现率有差
异，证实了组织问存在异质性的分离。例如某妇女，经
过多次提取口腔拭子和血样，检测出异质性，同个体
头发材料，5根是16355t，3根是16355c，2根是两种
型的混合物。提示在细胞分化、发育过程中也可能存
在另一种瓶颈。
二、mtdna异质性的类型及好发位置
异质性按其存在形式分为点异质性和长度异质
性两类，它既可发生在代问也可发生于代内。正常人
mtdna异质性高发于控制区，而编码区几乎没有。[61
通常，异质性序列之间差异仅限于某一个碱基，称
为点异质性。同时出现两个位置碱基序列不同的概率
虽小，但仍有报道：而同时出现3个或者3个以上的
情况至今尚未见报道。mtdna序列变异主要是复制过
程中碱基错配，其中转换占90％以上。少数是颠换。点
异质性主要集中于hvi和hvii。hvi碱基转换类型
多发生在嘧啶之间，约为80％。hvii的转换碱基中，
嘧啶与嘌呤约各占一半。颠换多发生于c和a之间．
并几乎都集中在hvi。人群中点异质性的发生率因检
测方法的灵敏度不同而差异很大。hvi 16 189nt碱基
替换的发生率很高，其中t—c转换高达l5％。
长度异质性主要发生于hvi 16184 16193 nt
和hvii 303—315 nt的c—stretch区，表现为c数目
的差异。在序列测定时可观察到16 189 nt和310 nt
后多个信号峰交叠形成的模糊序列，即“手指样结
构”。[71根据anderson序列，c—stretch分别于16 189 nt
和310nt被t阻断，可能由于复制滑动引起的相同碱
基单调连续趋势，该区被认为是突变的热点 而这一
趋势产生了长度异质性。bendall等[8】也认为长度异质
性形成原因主要是dna 复制滑动。无关个体问
mtdna长度异质性差异较大，根据hvii 303 309
nt碱基c数目的多少，可分为单纯同质性(c7)、轻度
异质性(c8为主)、明显异质性(c8和c9为主)和t—c
转换后序列失控(c10一c14)4种。hvi 16 189nt约
l5％的t—c转换中又有66％形成长度异质性。[91与
hvi不同，hvii的t很少缺失。由此认为hvii的长度
异质性机制是c在303—309 nt区域内的插入和复制
滑动，形成3lont p c的转换。同一母系中，与16 189
· l4l ·
突变相关的长度异质性，分布和变化相对稳定，但无
关个体问差异很大。bini等[1ol研究发现异质性长度c
的个数与c—stretch上游的a碱基数目呈负相关，相
对于c数目的不稳定性，同一个体a数目恒定，这一
发现对家系分析和法医学领域中包括单根毛发在内
的组织比较有较大意义。一般而言，如果c—stetch区
的c多于8个，就会增加长度异质性的几率。⋯1
通常．骨骼肌和神经组织的异质性水平相似，毛
发中相对较高．外周血的异质性最低。[121
三、mtdna异质性检测方法
(一)测序
序列测定是检测mtdna多态性和异质性最常用
的方法。尽管一直以来测序被认为是检测突变的金标
准，但若异质性水平低于20％该方法即很难检出，这
也是先前普遍认为异质性发生率很低的原因。克隆后
测序又比pcr产物直接测序更可靠，因其可排除因
pcr过程中taq dna聚合酶滑脱造成的序列改变。
对hvii轻链测序发现，由于临近c—stretch区产生的
长度异质性使3lont的异质性比率达50％，这是一种
普通的人为假象，通过对重链的测序可消除该假象。[131
因此为避免可能存在的影响，mtdna高变区序列测定
要求对重链和轻链进行双向测序，并至少重复一次。
(二)序列特异性寡核苷酸(aso)探针杂交
pcr—aso分析技术先用pcr扩增得到靶dna
片段，再用aso探针与目的dna扩增片段杂交．阳性
结果说明靶dna含有与探针相应的等位基因。尽管
pcr—aso分析技术有操作简单、灵敏度高、特异性好
等优点，但目前所用特异性探针较少，系统的个人识
别能力有限是其局限性之一。多重pcr特异性寡核苷
酸片段用于检测突变链，可以发现小于l％的异质性，
然而等位特异性扩增很容易受pcr初始熔链温度的
影响，易发生错误的扩增，且无法估计异质性的数量。
(三)限制性片段长度多态性(restriction 哪ent
length polymorphism，rflp)分析
在mtdna高变区，大约有2／3的碱基变异涉及限
制酶识别位点，故可用rflp检测点异质性。与直接测
序相比，荧光rflp分析较低程度的异质性更灵敏一
些。但应注意避免因不完全消化而导致错误的结论。
(四)单链构象多态性(single strand conformation
polymorphism，sscp)分析
pcr—sscp技术可灵敏地检测到单一碱基的突
变，且具有操作简单、快速、成本低、灵敏度高、无假阳
性等特点，适用于大样本dna突变的筛查。但存在影
响因素较多、条件不易掌握及带型难以解释等问题。
· 142 ·
基于毛细管电泳技术发展起来的荧光sscp(f—sscp)
技术，其灵敏度非常高，特异性好，但技术要求及成本
均很高。
(五)变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel
electrophoresis，dgge)
dgge是基于待测dnxx片段双螺旋的解链温度
(tm)来进行突变检测的，它具有灵敏度高、分离片段
可回收测序、一次可检测大量样本等优势。1999年，
steighner等㈣在评估pcr—dgge技术检测mtdna
hv1序列多态性的可靠性时。所有设计的49对配对
序列(每对仅存在1bp差异)用该技术可全部有效加
以区分。pcr—dgge技术检测异质性的灵敏度高达
l％ ，远远高于序列测定。但该技术存在实验之初需进
行计算机分析或预试验以确定最佳的分离条件、需使
用带gc—clamp的引物增加了实验费用、gc含量较高
的片段不易分析、制备精确的梯度凝胶需要熟练的操
作技巧及复杂的仪器设备、仅能检测突变的存在不能
确定突变的类型等不足
(六)变性高效液相色谱(denaturing high—performance
liquid chromatography，dhplc)技术
dhplc是一种可自动检测单碱基替代及小片段
核苷酸插入或缺失的一种高性价比分离技术．具有自
动化、快速、经济、检出率高、检出dnxx片段大小范围
广、既可分析已知突变也能筛查未知变异等优点．成
为目前分析已知或未知基因突变及单核苷酸多态性
的最佳技术平台。目前只有f—sscp技术在敏感性和
特异性方面能与dhplc相媲美。其不足是不能检测
纯合突变(要检测纯合变异一定要预混等量的野生型
样品以产生异源杂合双链)，只能提示突变的存在．无
法确定具体的错配类型及位置，尚需测序进一步确
定；许多片段有多个主要解链温度．需要筛查的温度
点较多，增加了工作量。
dhplc可直接通过异源双链的形成来检测异质
性的存在。如有必要，还可根据保留时间的差异将不
同的片段各自收集后测序
(七)其他检测方法
融解曲线分析、基质辅助激光吸附电离飞行时间
质谱(matrix assisted laser desorption lonization time
of flight mass spectrometry，maldy—tof—ms)．dna
芯片(dna chip)等技术，都可以用于mtdna异质性
的检测
四、mtdna异质性的法医学应用及展望
mtdna因其母系遗传特征、进化速率快、拷贝数
多等特点，使其在法医学鉴定中，尤其是对毛干、指甲
法律与医学杂志20xx年第13卷(第2期)
等无核生物检材或核dna分型失败的样本具有特殊
的应用价值。一方面，由于mtdna异质性的存在，使
其在进行常规个体识别和亲子鉴定等应用时使鉴定
结果产生不确定性；另一方面，mtdna异质性又可作
为个体的特殊标记，增加个体的认定或排除的确定
性。
法医个体识别鉴定中第一次遇到异质性问题是
末代沙皇尼古拉二世的遗骸鉴定案。l15】此后，mtdna
异质性问题逐渐引起法医学界的重视。早期研究认
为．mtdna的异质性在正常人群中很少见，可能与当
时的检测技术缺乏敏感性有关。随着相关技术的发
展．越来越多的文献报道在非编码区检出异质性，并
且以一定的频率存在于正常人群中。2o0o年，tully等
用dgge技术对253个随机个体血样的mtdna
hv1进行了分析．发现35个个体(13．8％)存在异质
性．其中33个为单核苷酸异质．2个为二核苷酸异质，
这些异质性共涉及16个不同的核苷酸．进一步证实
了mtdna异质性存在的普遍性。salas等 (20o1)报
告1例强监案的头发．在同一根被害人头发的2个不
同部位取材．竟然发现序列有差异．一个结果是16 093
t．16 189t：另一个结果是16093c／t．16 189c／t 由于
序列测定检测mtdna异质性灵敏度较低． 因而
mtdna异质性的出现对测序这种在法医学实践中应
用最广泛的mtdna鉴定手段是一种挑战
当比对两份mtdna的序列时．若dna序列相同
则表明这两份检材有可能来自同一个人或同一个母
系亲属，尤其是它们之间还具有相同的异质性时．这
种概率更大。国际法医遗传学会规定．在遇到两个样
本出现一个碱基不同，而且这个碱基位置被公认为是
异质性热点，则不能排除：当遇到两个碱基位置不同
时，如果两个位置都是异质性热点，则不能排除．否则
为不能判断。当出现3个位置的不同时．目前还没有
群体数据显示同一个体异质性同时在3个位置出现
的情况，在排除污染、细胞核假基因扩增产物的情况
下，并按照国际法医遗传学会mtdna标准操作方法
执行的，可以做出排除结论。为避免错排．尤其是比较
来自毛发mtdna样品时，建议尽可能多的分析样品．
需要再取其他的材料如多根头发、唾液或血样进行复
查，以减少因异质性存在而被错排的可能性．如果多
份检材的异质性出现在同一位置的同一碱基处．反而
对认定同一个体检材有利
mtdna的异质性发生机制及在人群中、个体内不
同组织中的发生频率究竟有多高． 目前还未明了．有
待于进一步研究。由于异质性的存在．对于个体识别
法律与医学杂志20xx年第l3卷(第2期)
的鉴定，必须正确评估mtdna在法医常规检案工作
的重要性。因此，要对样本做出相应准确可靠的判断，
首先要了解群体中异质性的分布情况．熟悉各种异质
性出现的概率和相应位置。这就要求对群体进行异质
性调查，建立相应的异质性数据库，从而为线粒体
dna在法医学上的应用提供有效保证。异质性的检出
在很大程度上依赖检测方法的灵敏度．但目前尚未有
标准化的方法来检测mtdna异质性．需要开发一种
标准化的检测方法作为金标准。
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(收稿：20xx—1 1—22；修回：20xx—03—02)
、! |、
(上接第s4页)
良后果承担完全责任。建议我国借鉴美国的相关规定
来立法。
4．智能障碍(痴呆)和遗忘综合征：这类吸毒者的
脑病理改变程度相当严重，恢复正常的可能性不大，
即使评定有刑事责任能力，也无受审能力和服刑能
力，为节省办案成本和发扬人道主义精神，建议对他
们评定为部分或者无刑事责任能力。
5．残留性或迟发性精神障碍
其中的痴呆和遗忘综合征按“智能障碍(痴呆)和
遗忘综合征”处理，其他的均评定为有刑事责任能力。
为缩减控制吸毒人数，有法学人士主张我国刑法
应规定吸毒为犯罪行为。事实上，吸毒人群的确是犯
罪的高危人群，吸毒者成瘾后一般都有人格改变，变
得缺乏责任心、喜欢说谎、自制力差和懒散等，加上作
为下临床诊断的主要症状之一，也就是意识障碍，它
不同于别的精神症状．即医生鉴定时往往不能当场直
接发现该症状，确定有无意识障碍主要依靠警方收集
的材料和被鉴定人案发后的积极配合，能指望爱说谎
的吸毒者积极配合查证吗?有鉴于此，鉴定医生诊断其
精神障碍的准确性和法庭对部分刑事责任能力结论的
采信度不无疑问。所以，笔者仍继续主张对精神异常的
吸毒者犯罪一般以完全刑事责任能力评定为最优。如
果吸毒诱发了自身原有的精神病，且本人对作案行为
丧失或减弱辨认或者控制能力，则评定为部分刑事责
任能力。不评定无刑事责任能力是因为吸毒本身为法
律所禁止，行为人未尽戒毒义务有一定的主观过错，对
这部分过错本人应该承担相应的法律责任。，mtDNA异质性及其法医学应用