大鼠脑挫伤后HIF-1α蛋白表达的法医学研究

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【摘要】目的探讨大鼠脑挫伤后hif—la蛋白表达的规律。方法参照feeney，s法建立大鼠脑挫伤模型，分
别于伤后2h，6h，12h，24h，2d，3d，5d，7d，14d取脑，运用免疫组化sabc法观察hif—la蛋白的表达。 结果对照组偶见
阳性反应细胞。损伤后2h，即可观察到hif—la蛋白表达。6h后表达明显增

强，24h达高峰，随后阳性反应细胞逐渐减
少，7d后仍可见少量表达，14d后恢复。表达呈弥漫性，以大脑皮层、海马、脑干最为明显，不同部位的变化趋势一致。
各实验组与对照组比较有统计学意义(p<0．05)。 结论hif一1a蛋白的表达规律可用于脑挫伤的鉴定及损伤经过时
间的推断。
【关键词】脑挫伤；法医学；hif—la；免疫组织化学；损伤经过时间
【中图分类号】d919．1
【文献标识码】a
【文章编号】1007—9297(20xx)o1—0076—03
study on the expression of hif—la protein after cerebral contusion in rats and its forensic impficafion．k伽g
dengfeng,liu yanjun，wang yingyuan．school offorensic n~dicine，shanxi medical university，taiyuan 030001，china
【abstract】objective to explore the expression of hif—la protein in diferent time after cerebral contusion(cc)．
methods based on feeney’s model of cc and took the samples at 2h，6h，12h，24h，2d，3d，5d，7d，14d after brain injury．the
expression of hif—la protein was observed by immunohistochemical sabc and image analysis techniques． results the
expression of hif-la protein could be detected at 2h after injury，increased at 6h and peaked at 24h．positive cells de—
creased with the prolongation of injury time．little expression was found at 7d． the control group and the 14d group
showed negative staining．the expression of hif—la protein was found in wide range but significant in cortex，hippocampus
and brain stem．the changing tendency of diferent areas was same．conclusion expression of hif—la protein is corre—
lated with post-traumatic intervals after cc in rats， suggesting that the expression of hif-let may be served as the mark—
ers for timing of cc in forensic practice．
【key words】cerebral contusion，forensic medicine，hypoxia inducible factor-let，immunohistochemistry，brain in—
jurytime
低氧诱导因子(hypoxia inducible factor一1，hif一
1)是一种随着细胞内氧浓度变化而调节基因表达的
转录激活因子。缺氧时它能诱导多种缺氧应激蛋白
基因的表达，从而介导各种缺氧适应性反应。它被证
实与神经细胞在缺氧状态下的生存及凋亡密切相
关。尽管hif—ltx已被证实为缺血、缺氧性脑损伤中
具有重要意义的信号转导途径之一，但对其在脑挫
伤后的表达变化规律研究极少。本实验通过检测脑
挫伤后不 www.duowen123.com (www.duowen123.com)同时间hif—ltx的表达情况，分析其变化
规律．旨为脑挫伤的法医学鉴定及损伤经过时间的
推断提供参考。
材料与方法
一
、实验动物分组
健康成年wistar大鼠66只(山西医科大学实
验动物中心提供)，体重250 g+10 g，雌雄不限，随机
分为12组。见表1。
表1 实验

动物分组
table 1 groups of experimental animals
[作者简介]亢登峰(1976一)，男，山西宁武人，硕士研究生，法医师，主要从事法医病理学研究。e—mai1：kdnxykjw@163．com。
[通讯作者]王英元(1958一)，男，山西稷山人，博士，教授，博士生导师。e—mail：wyy580218@163．com。
法律与医学杂志20xx年第14卷(第1期)
二、实验动物处理
损伤组动物参照feeneys法建立大鼠脑挫伤模
型。大鼠称重后，3％的戊巴比妥钠(40 mg／kg)腹腔麻
醉，大鼠脑立体定位仪固定大鼠头部，正中切开顶部
头皮，在人字缝前方3 mm、颅骨中线旁3 mm处，钻直
径5 bin的圆形骨窗。保持硬膜完整，采用自由落体打
击装置，以40g重锤从20cm高处下落打击。术后动
物常规进饮食。在伤后规定时间将大鼠麻醉后开胸，
剪开右心耳，以细管经左心室穿刺至主动脉，依次灌
注生理盐水、 多聚甲醛pbs液和10％蔗糖pbs液
约2 h。对照组直接灌流处死。假手术组仅行颅骨钻
孔，术后24h灌流处死。矢状位取材，固定。
三、常规he和免疫组织化学染色法
把固定好的标本梯度脱水后，制作10 i．zm冰冻
切片，行he和免疫组织化学染色法。操作步骤参照
试剂盒说明书进行，一抗稀释度为1：100，用pbs取
代一抗作阴性对照，以细胞核或胞浆出现棕黄4534535aaa色产
物为阳性结果。兔hif—lcdgg多克隆抗体购自武汉
博士德公司，sabc免疫组化试剂盒、dab显色试剂
盒购自北京莱博公司：其他试剂均为国产分析纯。
四、图像分析及统计学处理
各组切片运用bi一2000图像分析系统，在脑挫
伤区周围随机选取5个高倍视野(×200)，进行
· 。77 ·
hif一1仅免疫组化染色阳性细胞记数。实验数据采用
spss l1．5统计软件进行方差分析和q检验，数据以
均数±标准差(x+s)表示。
结 果
一
、he染色结果
对照组神经元细胞形态、结构正常，核染色较
淡、圆形，核仁明显；损伤组可见脑组织出血、挫碎，
蛛网膜下腔、侧脑室出血。所选切面各部位均可见程
度不一的神经元皱缩，染色较深，核深染，核仁消失，
突触减少，神经元细胞周围出现空隙，逐渐发展为神
经元坏死、胞核溶解。胶质细胞肿胀，细胞周围间质
水肿。
二、hif一1 oc蛋白免疫组织化学染色
对照组神经细胞偶见hif一1仪表达。伤后2 h组
即可观察到阳性反应细胞，呈散在少量分布，阳性产
物呈棕黄4534535aaa色，主要位于神经细胞胞核及胞浆内(照片
1)。伤后6 h可见表达hif—la的神经细胞数增多，
表达强度增强，差异有显著性(照片2)；24 h后达高
峰(照片3)。随后阳性反应细胞逐渐减少，7d后仍见
少量表达(照片4)；14d后恢复。表达呈弥漫性，以
大脑皮层、脑干、海马最为明显，不同部位的变化趋
势一致．阳性反应细胞包括神经元及各类胶质细胞。
hif一1仅蛋白表达的阳性细胞数，见表2。
表2 脑挫伤后ltif-lot阳性细胞计数
table 2 hⅱ’一1d positive cells count after cerebral contusion
注：★表示与对照组比较p<o．05：#表示与对照组比较／3>0．05o
讨 论
hif一1是在研究缺氧诱导促红细胞生成素
(erythropoietin，epo)基因表达时发现的，是一类由
两个亚单元hif一1仅、hif一113组成的异二聚体，其中
hif一1仅由826个氨基酸组成．分子量约120 kd，
含有两个转录激活区(transactivation domains，
tads)，一个称作n一末端激活区(n2terminal activa．
tion domain。nad)。另一个称作c一末端激活区(c—
terminal activation domain，cad)。另夕 ，hif一1仅还
含有一个独特的氧依赖降解区域(oxygen—dependent
degradation domain，odd)．在控制hif一1仅稳定方
面起关键作用lli21。hif一1仅在常氧状态下经泛素一蛋
白酶体途径被迅速降解，当机体处于低氧环境时，细
胞周围的氧分压降低，hif—la降解受阻，在胞浆中
累积．并核转位到细胞核中与hif一113结合形成有
活性的hif一1。hif—l仅与靶基因启动子或增强子缺
氧反应元件(hypoxia～response element，hre)上的5
一a／gcgtg一3 序列结合进而调节靶基因的表
·
78 · 法律与医学杂志20xx年第14卷(第1期)
照片l 伤后2h出现hif—l 阳性表达；照片2 伤后6h hif-la阳性表达明显增加；照片3伤后24h，阳性表达达高峰；照片4伤后7d少
量阳性细胞表达。ph0t0 1．the expre~ion of hif—la p~tein at 2h after cerebral contusion(sabc x200)；pho~ 2．hif—la po~tive-cells
and tbe inteilsity 0f stain increased remarkably in number at 6h after brain i ury(sabc x200)；pho~ 3．the inte璐ity and the area of
hw-la positive cells p~ked at 24h after uf (sabc x200)；photo 4．~tfle expression was found at 7d after i ury(sabcx200)
达。hif一1 o【作为低氧应答的全局性调控因子，能够
激活100多种低氧适应性基因的表达。hif—l 对基
因表达调节的广泛作用涉及血管发生、血管重塑、红
细胞生成、糖酵解等各个方面，因此是机体对氧浓度
改变的一系列自适应反应中最重要的调节因子。
脑挫伤后，脑组织缺血缺氧所致的氧化应激可
以诱导hif—l o【的表达升高，从而促使细胞凋亡，防
止细胞坏死甚至能够刺激细胞增殖。freret等[引在大
鼠脑持续缺血损害24 h后人工给予可诱导hif一1
表达，增加的药物去铁铵，结果发现可以显著降低脑
组织缺血后损害的面积(一28％)，这提示hif一1仅有
脑保护作用。实验表明 hif一1仅蛋白在脑血肿周边
神经细胞中有明显的表达，且随着出血时间的延长
hif一1d表达的阳性率逐渐增加，提示hif—l o【的表
达与神经细胞缺血、缺氧的时间密切相关。于如同等
报道创伤性脑损伤后hif一1 o【表达明显增高，细
胞凋亡率明显降低，在伤后3 h，大脑皮质、海马等部
位hif—l 表达增加，24～48 h达到高峰。提示hif—
l仅与创伤性脑损伤后神经细胞凋亡有关。
本研究对脑挫伤后不同时间引起hif一1 0【蛋白
的变化进行了观察．结果发现伤后2h hif一1仅阳性
表达较弱，6 h后hif一1 阳性表达的神经细胞逐渐
增多。随着时间的增加，hif一1仅阳性表达的神经细
胞增多。以神经胶质细胞为主，表达强度增加，表达
部位以损伤区周围大脑皮质、脑干、海马为主。因损
伤区、脑干和海马都是对缺血缺氧敏感的组织，这也
证实hif一1 与脑损伤后缺血缺氧有关。脑挫伤后
神经细胞处于缺血缺氧敏感期，可通过抑制蛋白酶
体降解hif一1仅和提高hif一1 0【的转录活性两种途
径．实现hif一1 o【表达持续增高。口咧随后细胞对缺
氧适应，蛋白酶体降解途径被中断．故出现hif一1
表达下降趋势。脑损伤后。神经胶质细胞逐渐活跃起
来。对神经组织起保护、修复、营养等作用，故伤后表
达hif一1 蛋白的阳性细胞中神经胶质细胞占主要
地位。目前认为缺氧对hif—l 的调节不在mrna
水平，而在蛋白翻译后水平，由于hif一1 0l蛋白表达
需从基因调控到转录、翻译等多个步骤，故在脑挫伤
早期没有hif一1 蛋白表达的明显增多，而在中、后
期，hif—l o【蛋白表达增多较明显。这种变化规律为
脑挫伤的法医学鉴定及脑损伤时间的推断提供了新
的方法，通过更加系统和进一步的研究可望应用于
法医学检案中。
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· 68 ·
每归不过三二分，仅供夫妇一餐之用。古人云：‘黎
民一天不再食则饥。’此数十万游惰之民肯枵腹而
鹄立于堂侧，走马于阶前乎?必不能也!”①众多衙役
“
⋯ ⋯ 肯枵腹而鹄立于堂侧，走马于阶前⋯ ⋯”个中
必有他们肯饿腹而效命的秘密。
封建社会衙役地位低，没有丰厚的收入．要养家
糊口．要吃饱饭，只有依靠各种“陋规”，而大部分“陋
规”都是衙役自定的．他们或明或暗，搜刮民膏民脂。
清代刘衡任四川巴县知县时，衙门里有七千多名衙
役(《庸史庸言》卷上)。浙江钱塘、仁和两个县，各有
正身白役一千五六百人。这么多没有正常收入的衙
役，自然以扰民生事为本能。1837年段光清说，知县
下乡验尸，带着仵作、刑书、门印、签押、小使、六房、
三班，以及本官仪卫、皂隶、马仆、轿夫一同下乡，多
达一百多人。仅一个县的衙役就如此之多，可想而
知全国的胥役有多少。所以一般都认为衙役是清代
地方政治的一大弊端，被称为“衙蠹”。一些“仵作”自
然也不能超然事外．与其他衙役一起欺上瞒下，收受
当事人贿赂．假唱虚报，瞒天过海，将一些暴力致死
的尸体说成是正常死亡，要“开验钱”、“洗手钱”等，
《吴下谚联》有：“仵作子帮衬活死人”之谚语，是指
“仵作”看案子的实际情况，审时度势，将轻的验成重
的，将重的验成轻的，从中捞取“私利”，或满足自己
法律与医学杂志20xx年第14卷(第1期)
的某种需要。实为社会之“蠹虫”。民间谚语有：“堂
上一点朱，民间千点血。”“仵作”或许在其中就扮演
着不甚光彩的角色。仵作是封建社会衙门里地位最
低、最没人羡慕的行当。
五、结论
无论从法律职能、检验方法，还是社会地位，封
建社会官衙中的“仵作”都不能与西学东渐而产生的
近现代“法医”相提并论。从“仵作”到“检验官”再到
“法医”．这是一个历时很久、逐渐演变的过程。其发
展过程实际上是中国社会发展形态的一个缩影。
“仵作”是“大人”的手、是“大人”的眼睛，在堂上
只能垂手侍立，一旁伺候。他只能验伤喝报，连填写
验尸格目的资格都没有．更谈不上由仵作来分析、判
断案情了，而且验尸仅停留在体表。1907年《大清新
刑律》的相关规定结束了沿袭千余年的仵作“验尸”
历史。1912年民国政府颁布的《刑事诉讼律》为解剖
开禁。
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[4] 谢启文主编．医学大辞海(法医学分册)[m]．沈阳出版社，20xx
(收稿：20xx—10—08；修回：20xx—11-24)
(上接第78页)
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